在顯微成像領(lǐng)域，特別是免疫熒光樣本成像中，當(dāng)標(biāo)記熒光素過多時(shí)，各個(gè)熒光素光譜發(fā)生重疊，采用傳統(tǒng)濾光片成像，單個(gè)通道會(huì)采集到多個(gè)熒光信號(hào)，發(fā)生通道串色現(xiàn)象，無法獲取純凈的單通道圖像。TissueGnostics公司利用液晶可調(diào)諧濾光器將多光譜成像技術(shù)應(yīng)用于顯微成像，對(duì)樣本進(jìn)行多光譜成像，即λ-stack成像，巧妙解決了通道串色問題。
TissueFAXS SPECTRA PLUS
正置系統(tǒng)
TissueFAXS SPECTRA i PLUS
倒置系統(tǒng)   液晶可調(diào)諧濾光器成像元件（ Liquid Crystal Tunable Filters）：
可濾光光范圍：420nm-730nm
步徑精度：1nm

在相同條件下，每一個(gè)熒光素分子的發(fā)射光譜、不同波長(zhǎng)位置的熒光強(qiáng)度比值都是固定的，這就為光譜拆分提供了理論基礎(chǔ)。在明確所有標(biāo)記熒光光譜的情況下，即可將其作為參照，進(jìn)行運(yùn)算得知多色標(biāo)記樣本中光信號(hào)分別是來源于哪一個(gè)熒光素及其所占比例，進(jìn)而通過信號(hào)拆分得到每一個(gè)熒光純凈的圖像數(shù)據(jù)。
光譜拆分技術(shù)解決了常規(guī)濾光片成像方式存在的通道串色問題，為多色標(biāo)記成像提供了可能和準(zhǔn)確的處理方法。

除此之外，免疫熒光實(shí)驗(yàn)中，自發(fā)熒光是非常常見的干擾，它不僅影響標(biāo)記熒光強(qiáng)度準(zhǔn)確定量，同時(shí)也會(huì)掩蓋弱的熒光信號(hào)。而且同組織內(nèi)自發(fā)熒光的物質(zhì)來源是基本相同的，所以自發(fā)熒光可以等同看作一個(gè)“熒光素”。在獲取其光譜后，同樣可作為參照，將自發(fā)熒光從樣本中拆解出來。

免疫組化實(shí)驗(yàn)中用到的蘇木素、DAB等色素和熒光素類似，每個(gè)色素都具有特異性吸收光譜，也可使用光譜拆分的方式將多色標(biāo)記組化樣本進(jìn)行拆分處理，提高明場(chǎng)免疫組化標(biāo)記數(shù)目。

該圖為熒光ECFP, EGFP和EYFP的獨(dú)立和重疊光譜。取得每個(gè)熒光素和自發(fā)熒光的光譜之后，即可將它們導(dǎo)入StrataQuest Unmixing Engine作為參照進(jìn)行多色標(biāo)記樣本信號(hào)拆分。

•利用多光譜成像技術(shù)對(duì)每個(gè)熒光素進(jìn)行特定波長(zhǎng)范圍成像，即λ-stack成像，快速獲取所有單標(biāo)熒光樣本參照光譜，同樣空白樣本自發(fā)熒光可等同視為一個(gè)“標(biāo)記熒光”，獲取其參照光譜。

•實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確光譜拆分，每一個(gè)熒光、自發(fā)熒光的參考光譜都是必須的。

下圖展示為TissueFAXS Spectra進(jìn)行明場(chǎng)樣本多光譜成像及處理工作流程。

通過λ stack成像獲取多光譜數(shù)據(jù)后，利用光譜拆分技術(shù)拆解混雜信號(hào)，最終獲得單標(biāo)記通道圖像。

光譜拆分算法明確了圖像中采集到每一個(gè)像素的信號(hào)分別是來源于哪些熒光素和各熒光素所占比例。

明場(chǎng)與熒光多光譜顯微成像主要應(yīng)用在：

•免疫組化多色素標(biāo)記樣本成像、信號(hào)拆分。

•免疫熒光多色標(biāo)記樣本成像、信號(hào)拆分，同時(shí)可扣除自發(fā)熒光。

•多光譜系統(tǒng)不僅支持多標(biāo)記染色成像和信號(hào)拆分，又可以提供更精準(zhǔn)的信號(hào)強(qiáng)度及形態(tài)學(xué)結(jié)果。