德國(guó)Lavision Biotec---雙光子熒光顯微鏡TriM Scope

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德國(guó)Lavision Biotec ---雙光子熒光顯微鏡TriM Scope
雙光子吸收/ 激發(fā)技術(shù)的原理：在強(qiáng)光激發(fā)下，分子同時(shí)吸收兩個(gè)光子，從基態(tài)躍遷到兩倍光子能量的激發(fā)態(tài)的過(guò)程。兩個(gè)光子可以是相同波長(zhǎng)的，也可以是不同波長(zhǎng)的，但必須是同時(shí)吸收（兩個(gè)光子到達(dá)被激發(fā)分子的時(shí)間間隔小于1 飛秒）?？梢赃@樣理解，先吸收一個(gè)光子的能量躍遷到一個(gè)虛擬的中間態(tài)，然后再吸收一個(gè)光子的能量躍遷到激發(fā)態(tài)。
雙光子顯微鏡相對(duì)于共聚焦等其他顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)：光損傷小：由于雙光子顯微鏡使用的是可見(jiàn)光或近紅外光作為激發(fā)光源，這一波段的光對(duì)活體細(xì)胞和組織的光損傷小，適用于長(zhǎng)時(shí)間的研究；穿透能力強(qiáng)：相對(duì)于紫外光，可見(jiàn)光和近紅外光都具有更強(qiáng)的穿透能力，因而受生物組織散射的影響更小，解決對(duì)生物組織中深層物質(zhì)的層析成像研究問(wèn)題；研究表明，共聚焦熒光成像的成像深度一般在50 微米左右，而雙光子顯微鏡的成像深度可達(dá)1000 微米；高分辨率：由于雙光子吸收截面很小，只有在焦平面很小的區(qū)域內(nèi)可以激發(fā)出熒光，雙光子吸收僅局限于焦點(diǎn)處的體積約為波長(zhǎng)3 次方的范圍內(nèi)；	北京大學(xué) 謝曉亮教授（北大長(zhǎng)江講座教授；哈佛講席教授，美國(guó)科學(xué)院院士）在美國(guó)哈佛大學(xué)使用LaVision BioTec的雙光子顯微鏡之后，在北京大學(xué)建立北京生物動(dòng)態(tài)光學(xué)成像中心之時(shí)，又再度引進(jìn)雙光子顯微鏡，并且給予顯微鏡該高度評(píng)價(jià)。 LaVision BioTec于2000在德國(guó)成立，作為一家專業(yè)的雙光子顯微鏡和OPO振蕩器、雙光子分光器等設(shè)備生產(chǎn)商，LaVision BioTec在短短的10年內(nèi)已經(jīng)成功的為歐美等國(guó)家諸多大學(xué)和研究所提供了超過(guò) 110套雙光子顯微鏡設(shè)備和 10多套片掃描（全面掃描）熒光顯微鏡，成為該領(lǐng)域質(zhì)量最好的供應(yīng)商。

LaVision BioTec 的 雙光子顯微鏡 TriM Scope 的獨(dú) 特優(yōu)勢(shì)（同類產(chǎn)品中獨(dú)有的優(yōu)點(diǎn)） :

☆ 全球獨(dú)有的多光束快速掃描模式：用戶可根據(jù)需要調(diào)節(jié)光束模式從傳統(tǒng)的單光束掃描模式到La Vision BioTec 獨(dú)有的多光束快速掃描模式，即1 、2 、4 、8 、16 、32 、64 束光的不同模式選擇。多光束平行掃描技術(shù)是指入射光經(jīng)過(guò)分光器，分解為64束光，同時(shí)進(jìn)入顯微鏡，通過(guò)物鏡聚焦在樣品上，通過(guò)XY掃描器利用這64束光同時(shí)進(jìn)行掃描，并調(diào)整Z軸進(jìn)行三維成像，保證最低的樣品損傷的同時(shí)極大地提高了掃描速度。

☆ 全球第一個(gè)可用軟件調(diào)節(jié)的雙光子顯微鏡： ImSpector Pro 軟件支持了先進(jìn)的掃描模式，并且支持用戶在ms 毫秒之內(nèi)切換掃描區(qū)域。因此，TriM Scope 是研究光活化、光釋放和光漂白（photo activation, uncaging and FRAP ）的理想完美工具。

☆ 同類產(chǎn)品中具有最優(yōu)的檢測(cè)效率： TriM Scop 可以支持最多達(dá)8 個(gè) non-descanned PMT, NDD 可以是cooled generation III GaAsP PMT 或者APD detector 可以多傳輸40% 效率的量子，比同類產(chǎn)品具備更佳的檢測(cè)效率。

☆ 世界上唯一能夠支持OPO 技術(shù)的顯微鏡： OPO 技術(shù)– 紅光和蛋白的激發(fā)：經(jīng)典的Ti:Sa 激光器成像紅光的能力是非常有限的，因?yàn)榻?jīng)典的激發(fā)波長(zhǎng)是1125 到1250 nm, 并不在Ti:Sa 激光器的轉(zhuǎn)換范圍之類。OPO 技術(shù)解決了這個(gè)問(wèn)題，因?yàn)樗軅鬏斂烧{(diào)的fs 激光脈沖到>1100 nm 的范圍。

第一代雙光子顯微鏡 ：LaVision BioTec 革新的技術(shù)提供了獨(dú)特的雙光子顯微鏡-TriM Scope I ：

☆ 用戶可根據(jù)需要調(diào)節(jié)光束模式：從傳統(tǒng)的單光束掃描模式到 La Vision BioTec 的多光束快速掃描模式，即 1 、 2 、 4 、 8 、 16 、 32 、 64 束光的不同模式選擇?？焖賿呙枘Ｊ郊纯杀ＷC最大可允許 64 束光同時(shí)掃描，并且保證最低的樣品損傷，主要有下面三個(gè)原因 :

Ø 64 束光能夠提供單光束的 64 倍熒光強(qiáng)度并且保證低損傷高熒光強(qiáng)度

Ø 保證了高的幀速率

Ø CCD 攝像頭比 PMTs 更高靈敏度

☆ TriM Scope 可以提供最多達(dá) 8 個(gè) NDD 攝像頭給經(jīng)典的單光束掃描顯微鏡， 2 個(gè) CCD 攝像頭， 1 個(gè) TCSPC 探測(cè)器為 FILM （ Fluorescence Lifetime Imaging Microscope ）測(cè)量。 3 個(gè) NDD 可以安裝到靠近物鏡的位置， 2 個(gè) NDD 可以插入到傳送器。

☆ LaVision BioTec 的 ImSpector Pro 軟件支持了先進(jìn)的掃描模式，并且支持用戶在 ms 毫秒之內(nèi)切換掃描區(qū)域。因此， TriM Scope 是研究光活化、光釋放和光漂白（ photo activation, uncaging and FRAP ）的理想完美工具。

☆ TriM Scope 還可以結(jié)合 1 個(gè) OPO 使用， OPO 可以轉(zhuǎn)換 Ti:Sa 激光器的波長(zhǎng)從 800-880 nm 轉(zhuǎn)變到 1100-1300 nm 。因此紅光染料或者蛋白質(zhì)可以被有效地激發(fā)出雙光子，保證了很低的漂白率和最深的穿透深度。 LaVision BioTec 可以同時(shí)使用 Ti:Sa 激光和 OPO 來(lái)掃描，就能同時(shí)激發(fā)出綠 / 黃和紅光。

Mitochondria	Hela cells	human skin

Biopsie of Lung	SHG & Red in Zebrafish	Image in Lung Slice

第二代雙光子顯微鏡 : LaVision BioTec 最新的雙光子顯微鏡- 第二代雙光子顯微鏡TriM Scope II 具有新的特點(diǎn)：

自動(dòng)校準(zhǔn)的雙光子顯微鏡
穿透最深的樣品深度，并能應(yīng)用OPO 技術(shù)
可升級(jí)到LaVision BioTec 的64 束光分光技術(shù)
多用戶使用環(huán)境中的雙光子顯微鏡

TriM Scope II 雙光子顯微鏡提供了第二代的雙光子顯微鏡，并且在各種使用環(huán)境下能夠完成快速、深度成像?；九渲檬菃喂馐鴴呙柙ㄕ脵C(jī)身和2 個(gè)靠近物鏡的NDD 檢測(cè)器。作為選件，該顯微鏡可以配置:

☆ LaVision BioTec 專利的光學(xué)分光器，用于64路光束的平行掃描

☆ 最多可達(dá)到8 個(gè)NDD檢測(cè)器

☆ 各種不同的CCD 攝像頭

☆ LaVision BioTec 的快速TCSPS檢測(cè)器

☆ 用于共聚焦檢測(cè)的descanned 檢測(cè)器

☆ 預(yù)啁啾補(bǔ)償器

☆ OPO 技術(shù)

友好的用戶界面和自動(dòng)的光束校準(zhǔn)

TriM Scope II 是第一個(gè)商業(yè)化的可用軟件調(diào)節(jié)的雙光子顯微鏡，激光束是由可選的 piezo 驅(qū)動(dòng)發(fā)光鏡，位置是由 photo diodes 監(jiān)測(cè)，因此，調(diào)整過(guò)程非常精確、安全和快速。結(jié)合最新的 ImSpector 軟件可以幫助用戶操作整個(gè)實(shí)驗(yàn)而無(wú)需花費(fèi)時(shí)間研究顯微鏡的高級(jí)的調(diào)節(jié)。尤其是多個(gè)用戶使用下， TriM Scope II 只需要很基礎(chǔ)的培訓(xùn)后即可使用。

優(yōu)化的激發(fā)光學(xué)：

成像質(zhì)量和光束條件 : 雙光子顯微鏡的分辨率和穿透深度主要取決于聚焦質(zhì)量和 Ti:Sa 激光器發(fā)射的脈沖波長(zhǎng)。選擇最佳的部件（激光和物鏡之間的所有的光學(xué)部件）從而實(shí)現(xiàn)最有效地激發(fā)和工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的光學(xué)通量。
適應(yīng)物鏡和焦距深 - 可調(diào)節(jié)光束直徑 : TriM Scope 含有一個(gè) triple lens telescope 允許客戶根據(jù)物鏡的后孔隙和焦距深度調(diào)節(jié)激光束的直徑。物鏡的后孔隙最大的光束直徑是 24 mm ，可以允許使用所有的新的低放大率高數(shù)值孔徑的物鏡。
物鏡 : 聚焦質(zhì)量和分辨率主要取決于物鏡，所以需要優(yōu)化物鏡。為達(dá)到最佳的適應(yīng)性， TriM Scope 可以搭配主要生產(chǎn)商的絕大多數(shù)鏡頭 (Leica, Nikon, Olympus 和 Zeiss) 。為達(dá)到最佳質(zhì)量， TriM Scope 只使用最優(yōu)于 fs 紅外脈沖而不損傷激發(fā)激光的光學(xué)組件。
優(yōu)化的脈沖波長(zhǎng) - 預(yù)啁啾補(bǔ)償 : 雙光子顯微鏡的成像的亮度直接與轉(zhuǎn)換脈沖長(zhǎng)度相關(guān)， TriM Scope 使用預(yù)啁啾補(bǔ)償來(lái)保證物體平面的激光脈沖長(zhǎng)度 < 150 fs 。預(yù)啁啾補(bǔ)償器、經(jīng)典的單光束以及多光束相關(guān)器件配合使用 (1, 2, 4, 8, 16, 32 和 64 路光束 ) 。 TriM Scope I 可以與正置、倒置顯微鏡組合使用，可以配合 8 個(gè) NDD 檢測(cè)器，用于共聚焦檢測(cè)的 descanned 檢測(cè)器，各種不同的 CCD 攝像頭， LaVision BioTec 的快速 TCSPS 檢測(cè)器和 OPO 技術(shù)。

優(yōu)化的檢測(cè)效率： TriM Scop 可以支持最多達(dá) 8 個(gè) non-descanned PMT , NDD 可以是 cooled generation III GaAsP PMT 或者 APD detector 可以多傳輸 40% 效率的量子。

OPO 技術(shù)– 紅光和蛋白的激發(fā)：經(jīng)典的 Ti:Sa 激光器成像紅光的能力是非常有限的，因?yàn)榻?jīng)典的激發(fā)波長(zhǎng)是 1125 到 1250 nm, 并不在 Ti:Sa 激光器的轉(zhuǎn)換范圍之類。 OPO 技術(shù)解決了這個(gè)問(wèn)題，因?yàn)樗軅鬏斂烧{(diào)的 fs 激光脈沖到 >1100 nm 的范圍。 TriM Scope 是唯一能夠支持該技術(shù)的商業(yè)化的顯微鏡。

FRAP, Uncaging and Photo Activation ： LaVision BioTec 的 ImSpector Pro 軟件支持了先進(jìn)的掃描模式，并且支持用戶在 ms 毫秒之內(nèi)切換掃描區(qū)域。因此， TriM Scope 是研究光活化、光釋放和光漂白（ photo activation, uncaging and FRAP ）的理想完美工具。

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優(yōu)化的檢測(cè)效率： TriM Scop 可以支持最多達(dá) 8 個(gè) non-descanned PMT , NDD 可以是 cooled generation III GaAsP PMT 或者 APD detector 可以多傳輸 40% 效率的量子。

優(yōu)化的檢測(cè)效率： TriM Scop 可以支持最多達(dá) 8 個(gè) non-descanned PMT , NDD 可以是 cooled generation III GaAsP PMT 或者 APD detector 可以多傳輸 40% 效率的量子。